через 10 минут экспозиции 20 % из них становились отрицательными.
Микроскопическое исследование окрашенного препарата не требует немедленного просмотра препарата, позволяет лучше изучить как морфологию трихомонад, так и другие элементы. Однако метод менее чувствителен и специфичен, а также более трудоемок. Частота обнаружения трихомонад в клинических материалах, полученных от пациентов с трихомониазом, помещенных на предметное стекло и окрашенных анилиновыми красителями, может составлять 30–62%. В препаратах, окрашенных по Граму, Лейшману, Романовскому–Гимзе, метиленовым синим по Леффлеру T. Vaginalis не всегда выявляется в типичной грушевидной форме. Во время фиксации и окрашивания препаратов трихомонады теряют свои морфологические особенности, что приводит к диагностическим ошибкам при микроскопическом исследовании. Чувствительность этого метода не превышает 60 %, специфичность – 95%.
Метод люминесцентной микроскопии при окрашивании препаратов акридиновым оранжевым используется редко. Также предложен метод окраски трихомонад по Филду, позволяющий различать живых и погибших паразитов с выявлением характерной ультраструктуры возбудителя.
В нашей стране диагностика трихомониаза осуществляется преимущественно методом микроскопического исследования окрашенных препаратов (в основном, метиленовым синим и по методу Грама), диагностические характеристики которого невысоки.
Культуральный метод с применением жидких или полужидких питательных сред в настоящее время считается «золотым стандартом» диагностики трихомониаза. К достоинствам культурального метода следует отнести его высокую специфичность (100 % при условии выявления активно подвижных трихомонад) и низкий порог чувствительности, составляющий от 10 паразитов/мл до 300–500 паразитов/мл образца, который во многом определяется качеством используемых питательных сред. Чувствительность культурального метода по сравнению с МАНК варьируется от 35 % до 96 %, в зависимости от качества транспортных и культуральных питательных сред и условий культивирования. Метод не лишен некоторых ограничений, таких как трудоемкость и длительный срок культивирования (от 2 до 7 дней с ежедневным микроскопическим исследованием), высокие требования к условиям транспортировки и хранения клинических образцов. Контаминация проб микроорганизмами может потребовать дополнительных пассажей, увеличивающих срок и стоимость исследования. Пассаж (пересев) через 2–3 дня культивирования снижает бактериальную контаминацию и может потребоваться для окончательной идентификации T. vaginalis. Трихомонады способны вступать в медленную фазу роста, и даже в чистой культуре иногда может наблюдаться задержка роста от 24 до 48 часов, прежде чем проявится характерный рост организма.
Трихомонады относят к факультативным анаэробам, они аэротолерантны, при их культивировании предпочтительны микроаэрофильные условия. Исследования качества различных сред показали, что к числу самых оптимальных относятся среды Hollander, Diamond-modified и СPLM, с чувствительностью до 96 %; однако, вышеперечисленные питательные среды отличаются высокой стоимостью.
Метод с использованием клеточных культур, в частности клеток линии McCoy, способен определять T. vaginalis в концентрациях менее 3 организмов в 1 мл вагинального отделяемого. В опытах in vitro показано, что T. vaginalis тропны к клеткам эпителия влагалища, по сравнению с другими типами клеток. Однако выделение трихомонад в культуре клеток – это не простой рутинный метод, он дорогой и трудоемкий.
Очевидно, оправданным можно считать опыт ряда зарубежных стран
(Англия и другие), где практикуется одновременное проведение микроскопического и культурального исследования материала при клинико-лабораторном обследовании пациента с подозрением на хламидийный цервицит и вагинит, что повышает качество диагностики и сокращает сроки обследования.
Иммунологические методы
Ограничения микроскопического и культурального методов исследования оказали стимулирующее влияние на внедрение альтернативных методов диагностики трихомониаза. К их числу относятся иммунологические методы, как для выявления антигенов T. vaginalis, так и для выявления антитрихомонадных антител.
Среди серологических тестов для определения антител к T. vaginalis в настоящее время безусловным лидером как по диагностическим характеристикам, так и по простоте исполнения, является иммуноферментный анализ (ИФА). В работе таких систем имеется ряд недостатков, обусловленных зависимостью иммунного ответа от различных факторов, характеристиками тест-систем, свойствами возбудителя. Чувствительность этих тестов составляет в среднем 82%, специфичность – 73%.
Поскольку антитрихомонадные антитела могут циркулировать в сыворотке крови в течение длительного времени после лечения, то дифференцировать таким образом текущую и перенесенную ранее инфекцию проблематично. Отсутствие адекватной модели с использованием лабораторных животных для исследования иммунного ответа при трихомониазе является серьезным ограничением для изучения возможностей серологического метода. Установлена корреляции наличия антитрихомонадных антител и онкологической патологии.
Для выявления антигенов T. vaginalis разработано несколько тестов. Как правило, чувствительность тестов для выявления антигенов трихомонад выше, чем чувствительность микроскопического метода исследования «нативного» препарата, но уступает (или сопоставима с ней) чувствительности культурального метода исследования. Бесспорным преимуществом данных тестов, по сравнению с традиционными методами диагностики трихомониаза, является то, что для интерпретации результатов исследования
не нужны живые трихомонады.
Прямое определение специфических белков T. vaginalis, таких как клеточный разъединяющий фактор (cell-detaching factor, СDF) и цистеин-протеаза (cysteine protease), являющихся иммуногенами всех наблюдавшихся
изолятов T. vaginalis, с использованием моноклональных антител в качестве быстрого метода диагностики трихомониаза показало результаты, аналогичные результатам метода микроскопии «нативного» препарата. Прямой иммуноферментный и иммунофлюоресцентный анализ выявления антигенов трихомонад в клинических материалах, полученных из влагалища, с использованием коммерческих тест-систем Trichomonas, использующий смесь меченных перокидазой и флюорохромом моноклональных антител к различным структурам T. vaginalis, показали аналитические характеристики, сравнимые с культуральным методом. Достоинством данного теста является также то, что результаты тестирования становятся доступны в течение одного часа.T. vaginalis может быть обнаружена методом прямой иммунофлюоресценции в отделяемом влагалища, а также иммунопероксидазным методом при цитологическом исследовании фиксированных цервикальных проб. Данные методы имеют достаточно высокую чувствительность (79– 90%) и специфичность (98–100 %) по сравнению с культуральным методом. Недостатком иммунологических методов является то, что для их выполнения требуются специальное оборудование; кроме того, эти методы достаточно дороги.