В правление Софьи власть в Левобережной Украине фактически находилась в руках её фаворита Василия Голицына. Мазепа снискал его расположение, а после падения Самойловича был избран гетманом. Самойловича сослали в Сибирь, сына его, Григория, казнили. Видимо, какую-то роль сыграл в этом и Мазепа. Он был мастер интриги.
Н. И. Костомаров так писал о нём: «В нравственных правилах Ивана Степановича смолоду укоренилась черта, что он, замечая упадок той силы, на которую прежде опирался, не затруднялся никакими ощущениями и побуждениями, чтобы не содействовать вреду падающей прежде благодетельной для него силы. Измена своим благодетелям не раз уже выказывалась в его жизни. Так он изменил Польше, перешедши к заклятому её врагу Дорошенку; так он покинул Дорошенка, как только увидал, что власть его колеблется; так, и ещё беззастенчивее, поступил он с Самойловичем, пригревшим его и поднявшим его на высоту старшинского звания. Так же поступал он теперь со своим величайшим благодетелем, перед которым ещё недавно льстил и унижался» (Костомаров, Н. И. Мазепа. Москва, издательство «Терра», 2004).
Костомаров, разумеется, имел в виду Петра I.
С 1689 года российский император получал на Мазепу доносы, говорившие о его измене. Пётр доносам верить не хотел; доносчиков наказывали, а доверие царя к гетману только возрастало. Так продолжалось и в июле 1704 года, когда. Мазепа сам перешёл в наступление обвинил Фастовского полковника Семёна Палия в измене (Фастов город в Киевской области). Палий был отправлен в Москву, а оттуда сослан в Тобольск.
1706 год был годом политических неудач Российского государства: польский король Август II был вынужден отказаться от престола. Несмотря на победу в сражении под Калишем (город в Польше), Россия осталась в войне со Швецией в одиночестве. В этих обстоятельствах Мазепа вступил в тайные переговоры с новым польским королём Станиславом Лещинским, ставленником Карла XII. Договорились так: Мазепа предоставляет шведам зимние квартиры, продовольствие и фураж и пытается склонить на сторону Карла запорожских и донских казаков, а также калмыцкого хана. Пётр I об этом не знал, так как после казни Василия Кочубея и Ивана Искры жаловаться на Мазепу запорожцы опасались.
Осенью 1708 года царь Пётр пригласил Мазепу присоединиться с казаками к русским войскам под Стародубом (город в Брянской области). Мазепа медлил, ссылаясь на свои болезни и смуты в Малороссии. В то же время он совещался со старшинами, примкнувшими к нему, и вёл переговоры с Карлом и переписку с Меншиковым. Меншиков решил навестить якобы больного Мазепу. Опасаясь разоблачения, Мазепа с гетманской казной бежал в конце октября с левого берега Десны к Карлу. С ним было всего полторы тысячи казаков. Из шведского лагеря гетман написал письмо Скоропадскому. в то время Стародубскому полковнику, разъясняя причины своего перехода и приглашая старшину и казаков последовать его примеру. К шведам, кроме отряда Мазепы, позднее присоединилась часть запорожского войска тоже около 1500 человек.
Пётр I был вне себя. Он отдал приказание князю Меншикову двинуть из Киева в Запорожскую Сечь три полка русских войск под командованием полковника Яковлева, и 11 (22 мая) 1709 года Сечь была полностью разрушена. Были взяты в плен кошевой атаман, войсковой судья, 26 куренных атаманов, 250 казаков. Из того числа 5 человек умерли от пыток, 156 атаманов и казаков казнено, причём несколько человек были повешены на плотах, и эти плоты пущены были вниз по Днепру на страх другим.
Карлу XII Мазепа обещал зимовку в городе Батурине резиденции гетмана. Там были значительные запасы провианта, много пушек, имелся хорошо подготовленный и преданный Мазепе гарнизон, Но планам Мазепы и Карла помешали войска Меншикова, взявшие крепость и все припасы в ней. Батурин был разорён, а гарнизон наёмников уничтожен.
Шведам пришлось выйти из тёплых хат на лютый мороз. Более ста шведских солдат отморозили себе руки и ноги, несколько десятков погибло.
Но Карл не сдавался. Он взял Зеньков, Опашню (города в Полтавской области) и Лебедин (Сумская область). Эти действия шведов спровоцировали начало партизанской войны, которую вели, прежде всего, крестьяне и которая делала положение Карла ещё более тяжёлым.
Тем временем был избран новый гетман Иван Скоропадский, а Мазепа был предан вечному проклятию.