В следующем, 1598 году человек короля Ян Кошиц вместе с киевским возным Лаврентием Толочко и двумя шляхтичами, прибыв к Лавре, нашел монастырские ворота запертыми и у ворот несколько сот вооруженных казаков, гайдуков и слуг монастырских. Тотчас вышли и монахи и на предложение Кошица впустить его в Лавру для передачи ее Рагозе отвечали: "Знаем, зачем ты приехал и какие имеешь листы от короля; тех листов и слышать, и видеть не хотим и монастырь наш крепко охранять будем. Король ничего не имеет до нас, и мы не должны его слушать, так как он нарушает наши права и вольности". Кошиц старался склонить монахов к уступчивости, но они остались непреклонными.
По кончине архимандрита Никифора (Тура) в 1599 году, король Сигизмунд и униатский владыка Ипатий (Потей) несколько раз пытались прибрать к рукам Киево-Печерскую Лавру, но братия, поддержанная воеводой киевским, князем Константином Константиновичем Острожским, смогла отстоять свое право свободного выбора настоятеля.
В 1605 году, наконец, был избран преемник архимандрита Никифора – архимандрит Елисей (Плетенецкий). Это был очень деятельный настоятель; он не только защищал Лавру и другие обители и их владения от нападения униатов, но и в 1614 году основал в Киево-Печерской Лавре типографию.
В 1616 году типография Киево-Печерской Лавры выпустила свою первую книгу "Часослов".
В 1619 году в типографии Лавры вышла вторая книга "Анфологион" – избранная Минея на весь год.
В 1620 году православные, собравшиеся со всех областей Речи Посполитой в Киево-Печерскую Лавру на праздник Успения Божией Матери просили Иерусалимского Патриарха Феофана, бывшего проездом на Украине, восстановить православную иерархию, разрушенную унией. В результате митрополитом Киевским был поставлен Иов (Борецкий).
Польский король Сигизмунд III, рьяно поддерживавший унию, так и не признал восстановленную православную иерархию. Под покровительством короля продолжились и нападения униатов на Киево-Печерскую Лавру.
В 1624 году скончался печерский архимандрит Елисей, его преемником стал архимандрит Захария (Копыстенский).
В 1627 году архимандритом Киево-Печерской Лавры становится Петр (Могила). Будучи весьма образованным человеком, он создает в 1651 году в Лавре высшее училище и объединяет его со школой киевского братства.
В 1652 году, по инициативе нового короля Владислава, печерский архимандрит Петр избран митрополитом Киевским. Новому митрополиту пришлось столкнуться со многими проблемами, в разрешении которых деятельную помощь ему оказывала печерская братия.
Одним из таких дел было усовершенствование системы православной проповеди, в противовес католической. Для этого были необходимы книги, выпускаемые типографией Киево-Печерской Лавры. В 1655 году в типографии Лавры был издан "Патерикон" Сильвестра Косова, а в 1658 году "Тератургимы, или Описание земли чудес, как в самом Печерском монастыре, так и в обеих святых пещерах" Афанасия Кальнофойского. Цель обоих изданий – явить жития печерских святых гражданам католической Речи Посполитой и заградить уста тем, кто говорил о безблагодатности Православной Церкви.
В 1645 году по инициативе митрополита Киевского Петра, с благословения Константинопольского Патриарха, происходит канонизация шестидесяти девяти подвижников Киево-Печерской Лавры. Одновременно в лаврской типографии выходит "Правило молебное ко Преподобным Отцем нашим Печерским и всем Святым, в Малой России просиявшим, певаемое, когда и где кто изволит".
В 1644 году была отреставрирована церковь Спаса на Берестове (Преображения Господня).
В 1656 году настоятелем Киево-Печерской Лавры становится архимандрит Иннокентий (Гизель). По его инициативе в 1661 году в типографии Лавры выходит первое печатное издание Киево-Печерского Патерика, а в 1674 году – "Синопсис Киевский", сочинение самого архимандрита Иннокентия. Также в настоятельство архимандрита Иннокентия в Лавре в 1674 году была построена первая деревянная колокольня, а в 1679 году Аннозачатьевская церковь.
После кончины архимандрита Иннокентия в 1685 году его преемником избран Варлаам (Ясинский).
В 1687 году Киевская митрополия воссоединилась с Московским Патриархатом. В следующем, 1688 году за Киево-Печерской обителью закреплено звание Лавры, уже в Московской юрисдикции.
Так для Киево-Печерской Лавры ушла в прошлое борьба с унией, следующий период в жизни обители – это время церковного строительства. В 1691 году в пещерах был сооружен храм во имя преподобного Варлаама, игумена Печерского. В 1696 году была построена церковь в честь Рождества Богородицы. В том же году началось строительство церквей Воскресения Господня и преподобного Феодосия Печерского на средства белоцерковского полковника К. Мокиевского.
Вообще в это время богатая казацкая старшина щедро жертвует на украшение Киево-Печерской обители. Благодаря их пожертвованиям были отремонтированы Успенский собор и Троицкая церковь. Печально известный гетман Иван Мазепа в 1700 году дает обители средства на строительство новых стен и башен. В том же году полтавский полковник Павел Герцик жертвует средства на строительство каменной Крестовоздвиженской церкви.
В 1718 году Киево-Печерскую Лавру ждало новое испытание – страшный пожар, начисто уничтоживший все деревянные постройки и повредивший каменные. Во время этого пожара погибла обширная лаврская библиотека и многие архивы. Узнав об этом, император Петр I, обычно равнодушный к церковному строительству, сделал щедрое пожертвование на восстановление Лавры. Тем более, о Киево-Печерской обители позаботилась казацкая старшина, давшая большие средства на восстановление и благоукрашение Печерского монастыря.
Благодаря пожертвованиям обитель быстро восстанавливается. Уже в 1720 году была построена новая лаврская типография. Одновременно начат ремонт Успенского собора, завершившийся в 1729 году. В 1751 году взамен сгоревшей деревянной колокольни в Киево-Печерской Лавре начинается строительство каменной, ныне известной как Великая Лаврская колокольня.
В 1765 году строится колокольня на Ближних пещерах. В том же году в Лавре создается собственная иконописная мастерская.
С 1786 года, согласно указу Святейшего Синода, Киево-Печерская обитель вновь входит в юрисдикцию Киевского митрополита, отныне именуемого священноархимандритом Лавры. Согласно тому же синодальному указу, первым лицом после настоятеля в Лавре был наместник – как правило, игумен или архимандрит. Всеми делами монастыря управлял Духовный Собор во главе с наместником. В его состав входили руководители лаврских ведомств. По духовным штатам следующим по старшинству после наместника был казначей. В его ведении находились книги прихода и расхода всех лаврских ведомств. Начальник счетного стола сверял приходные и расходные статьи, составлял ежемесячные и годовые ведомости. Благочинный отвечал за порядок в Лавре, наблюдал за поведением монахов, послушников, распоряжался караулом. Экклезиарх ведал всеми лаврскими церквами, ризницами, утварью, выделкой и продажей свечей, колокольным благовестом и церковной стражей. Келарь ведал трапезной, просфорней и всеми съестными припасами. Помощником келаря был "ключник погребный". Блюстители обеих пещер стояли во главе братии пещер и наблюдали за порядком в пещерах и пещерных церквах. На попечении больничного начальника были больные и престарелые из числа лаврской братии. Эконом внутренний распоряжался всем имуществом внутри Лавры; эконом внешний руководил лаврскими угодьями и хозяйством вне Киева. Типограф управлял типографией. Библиотекарь ведал лаврской библиотекой. Для исповеди монахов избирался ими духовник.
В 1845 году вокруг нижней территории Лавры была построена стена. Примерно в это же время на пожертвование графини А. Орловой-Чесменской в Лавре строится трапезная для бедных и больница. На ее же средства в Успенском соборе был устроен новый иконостас.
В 1860 году в Лавре было открыто мужское двухклассное народное училище для детей штатных служителей и жителей Киева.
Впоследствии оно было названо лаврской двухклассной церковно-приходской школой.
В 1895 году начинается строительство новой Трапезной церкви и трапезной палаты.
В 1894 году начинается ремонт Успенского собора. В 1898 году рабочие, ремонтировавшие Успенский собор Киево-Печерской Лавры, открыли в стене нишу, в которой оказался один из богатейших кладов Восточной Европы. Здесь были спрятаны 4 больших оловянных сосуда, а также двухведерная деревянная кадушка, наполненные золотыми и серебряными монетами. В кладе было 16 079 монет, медалей, жетонов, из них 6184 золотых весом 27,45 кг и 9895 серебряных, которые весили 275, 44 кг. Не считая золотого римского медальона Констанция II (557–561), который, возможно, происходит из какой-либо находки и не сразу попал в монастырь, монеты и медали охватывают период со второй половины XVI до начала XVIII века.
В 1901 году ремонт Успенского собора был завершен, фрески на стенах храма выполнены под руководством В. В. Верещагина.
В 1911 году в Киеве был убит премьер-министр П. А. Столыпин. Согласно его завещанию – похоронить его там, где он будет убит, – Столыпин похоронен в Киево-Печерской Лавре.
После революции 1917 года Киево-Печерская Лавра не осталась в стороне от внутрицерковных нестроений и от гонений новой власти на Церковь. 25 января 1918 года был расстрелян живший в Лавре митрополит Киевский, священномученик Владимир (Богоявленский). Незадолго до этого архиепископом Алексием (Дородницыным) и подстрекаемыми им монахами Лавры был пущен слух, что митрополит прячет несметные сокровища. Когда этот слух дошел до революционных матросов, они явились в Лавру и попытались выведать у владыки, где спрятанные им сокровища. Когда же они убедились, что слух был ложным, они забрали митрополита Владимира, вывели его из Лавры и расстреляли.