Разобрались с репликацией ДНК, расшифровали генетический код, то есть разгадали, каким образом можно записывать последовательности из 20 аминокислот четырьмя нуклеотидами. Оказалось, природа использует элегантный шифр – каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида; таких комбинаций существует, как нетрудно подсчитать, 64, поэтому одной аминокислоте могут соответствовать несколько триплетов – код вырожденный, как говорят математики.
Стало понятно, что ДНК в ядре клетки – это библиотека, в которой книги не выдают на дом, но позволяют снимать копии и забирать с собой. Или, в современных образах, – магазин электронных книг, который может продать бесконечное количество экземпляров той или иной книги в удобном для чтения формате. Копии книг – это матричные РНК, рибосомы (клеточные машинки для синтеза белка) читают их по триплетам и в соответствии с этими триплетами строят белок. Таким образом, поток информации идет в направлении от ДНК к РНК и затем от РНК к белку. Это и есть центральная догма молекулярной биологии, которую сформулировал Фрэнсис Крик в 1958 г.
Возможно, “догма” не самое подходящее слово. Как писал историк молекулярной биологии Хорас Джадсон в книге “Восьмой день творения” (The Eighth Day of Creation) о своем разговоре с Фрэнсисом Криком: “«Я имел в виду, что догмой называют идею, для которой нет обоснованных подтверждений. Понимаете?!» Крик издал восторженный рев. «Да я просто не знал, что значит «догма»! И мог бы с тем же успехом назвать ее Центральной Гипотезой или как-то в этом роде. Это я и хотел сказать. Догма – только слово-крючок»”. В любом случае сегодня центральная догма “ДНК → РНК → белок” ни у кого не вызывает ни малейших сомнений: обоснованных подтверждений более чем достаточно. Хотя теперь известно, что информация может передаваться от РНК к ДНК (например, в жизненном цикле некоторых вирусов с РНК-геномом), общей картины это не меняет. Магистральный поток информации направлен от ДНК к белкам – строителям и строительным материалам всего живого.
Как читать ДНК
Фредерик Сенгер и его метод секвенирования
Конечно, все захотели читать ДНК – черпать информацию о жизни прямо из источника. Но как читать буквы, если эти буквы – молекулы?
Необходим был удобный метод определения нуклеотидной последовательности, и такие методы стали появляться. Правда, большая часть их сегодня имеет лишь историческую значимость: для нынешних биологов “плюс-минус” секвенирование или “секвенирование по Максаму – Гилберту методом химической деградации” – что-то вроде микроскопа Левенгука.
Слово “секвенирование”, собственно, и означает “определение последовательности” (от англ. sequence); говорят о секвенировании ДНК, РНК, белков. Предложенное в 1970 г. секвенирование по Максаму – Гилберту, если коротко, подразумевало расщепление ДНК в растворах, организованное таким образом, чтобы получались молекулы всех возможных длин. Но это не самый рациональный подход. ДНК – именно та молекула, которая умеет копироваться сама на себе. Если взять у клетки ферменты, которые работают с ДНК, и научиться их использовать в наших целях, можно добиться многого. Почему бы, например, вместо того чтобы нарезать ДНК столькими способами, сколько в ней букв, не нарастить на ней дочерние цепи всех возможных длин? На этой идее основано секвенирование по Сенгеру – метод, также изобретенный в 70-е гг. прошлого века и благополучно доживший до наших дней.
Английский биохимик Фредерик Сенгер (1918–2013) – один из четырех человек, получивших две Нобелевские премии, и единственный, у которого обе – по химии (1958 и 1980 гг.): за определение структуры белка инсулина и за метод секвенирования ДНК. В 1975 г. Сенгер в совместной статье с Аланом Коулсоном представил метод “плюс-минус” секвенирования[10]. С помощью этого метода группа Сенгера почти полностью прочла геном бактериофага φX174 (5386 нуклеотидов) – по тем временам большой успех[11]. Однако все эти достижения затмило секвенирование по Сенгеру методом терминаторов, он же метод обрыва цепи, или дидезоксиметод[12]. Но сначала нужно объяснить, как молекулы ДНК сортируют по размеру с помощью электрофореза.
Мы помним, что ДНК – это кислота. Кислотные свойства определяются остатками фосфорной кислоты в ее составе – фосфатами. Из школьного курса известно, что анионы кислоты заряжены отрицательно: H
3
4
+
2
4
–
Теперь можем рассказать, как работает метод Сенгера. Реакционную смесь делят на четыре части. В каждую из четырех добавляют праймер (затравку для синтеза) – короткую молекулу ДНК, комплементарную началу участка, который нужно секвенировать. Праймер связывается с этим участком, образуя с ним двойную спираль. (Исследуемую ДНК перед этим, конечно, надо “расплести”, сделать однонитевой.) Фермент ДНК-полимераза, используя анализируемую ДНК в качестве матрицы, начинает наращивать праймер, соединяя в цепочку нуклеотиды. К обычным нуклеотидам в реакционной смеси добавлены необычные. Во-первых, некоторые нуклеотиды содержат радиоактивную метку (потом объясню зачем). Во-вторых, в каждой из четырех смесей небольшое количество одного из четырех нуклеотидов модифицировано – лишено OH-группы. К такому нуклеотиду (дидезоксинуклеотиду) нельзя присоединить следующий. А количество подобрано таким образом, чтобы среди новых цепочек были оборванные на каждом аденине – в одной пробирке, тимине – в другой, гуанине – в третьей, на каждом цитозине – в четвертой. И если потом внести реакционные смеси в лунки и провести электрофорез, получатся “лесенки”. Сложно, но станет яснее, если посмотреть на рис. 5 и 6.
Автоматическое распознавание
Как это происходило на практике? О-о… Классическое секвенирование по Сенгеру – процедура, которая у старшего поколения ассоциируется с золотым веком молекулярной биологии, когда было мало простого, покупного и готового и все умели работать руками, не то что сейчас. Не удержусь и расскажу подробнее: я ее еще застала.
Итак, гель нам понадобится не агарозный, как для крупных фрагментов, сильно различающихся по размеру, а полиакриламидный и очень тонкий. Разделить молекулы ДНК, различающиеся всего на один нуклеотид, – серьезная задача. Гель готовим из акриламида (канцероген; распишитесь, студенты, что поняли, а также насчет радиоактивной метки – хоть фосфор-32 и смешной по активности изотоп, но все-таки пить его не надо). Горячую прозрачную жидкость заливаем в пространство между двумя идеально плоскими стеклами размером примерно А3 с зажатыми по краям полосками пластика – спейсерами. Стеклянная струйка сбегает вниз, гель заливается, заливается, залива… черт-черт, пузырь застрял и не всплывает! Подхватываем что-нибудь твердое, вроде ножниц, стучим по стеклу деликатно, но сильно: уходи, пузырь, уходи! Если повезло, пузырь неохотно поднимается вверх, если нет – застывает в геле, делая значительную его часть непригодной для фореза, а студент слышит у себя за спиной: “Ничего, ручки кривые, зато старательный”… Сверху заливаем чуть менее крепкий гель, в который вставляют гребенку, чтобы получились лунки. Ждем. Гель застыл. В реакционные смеси добавляем глицерина, чтобы смесь не всплывала в растворе, а сиропчиком оседала на дно лунки, а также синего и фиолетового красителя с отрицательно заряженными молекулами, чтобы видно было, достаточно ли далеко прошел форез: раствор ДНК сам по себе прозрачен, по нему не поймешь. Вносим смесь в лунки. Аккуратненько, только не мимо лунки, а то будет каша. Не путаем, что куда, запоминаем, а лучше записываем. Готово. Ставим электрофорез. На табло источника питания четырехзначное число, обозначающее вольты, кстати, распишитесь, студенты, что поняли насчет высокого напряжения.