4. Оптимальный электронный потенциал, свидетельствующий о содержании в среде растворенного кислорода. Он должен быть высоким для аэробов и низким для анаэробов.
5. Прозрачность (чтобы был виден рост бактерий, особенно для жидких сред).
6. Стерильность (чтобы не было других бактерий).
Поскольку бактерии обладают различными свойствами, то для их выращивания и изучения требуется достаточно большое количество питательных сред, которые бы имели различное происхождение, состав, консистенцию и назначение. Поэтому была введена классификация питательных сред.
Классификация питательных сред
I. По происхождению:
1) естественные (молоко, желатин, картофель и др.);
2) искусственные – среды, приготовленные из специально подготовленных природных компонентов (пептона, аминопептида, дрожжевого экстракта и т. п.);
3) синтетические – среды известного состава, приготовленные из химически чистых неорганических и органических соединений (солей, аминокислот, углеводов и т. д.).
II. По составу:
1) простые – мясопептонный агар, мясопептонный бульон, агар и бульон Хоттингера и др.;
2) сложные – это простые с добавлением дополнительного питательного компонента (кровяного, шоколадного агара): сахарный бульон, желчный бульон, сывороточные агар и бульон, желточно-солевой агар, среда Китта-Тароцци, среда Вильсона-Блера и др.
III. По консистенции:
1) твердые (содержат 3–5 % агар-агара);
2) полужидкие (0,15–0,7 % агар-агара);
3) жидкие (не содержат агар-агара).
IV. По назначению:
1) общего назначения – универсальные – предназначены для культивирования большинства бактерий, так как содержат питательные вещества, в присутствии которых растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий (мясопептонный агар, мясопептонный бульон, кровяной агар). Тем не менее из-за большого разнообразия бактерий и их питательных потребностей создать такую универсальную питательную среду, чтобы она была пригодна для культивирования любых бактерий, практически невозможно;
2) специального назначения применяются для выращивания бактерий, не способных размножаться на универсальных средах:
а) элективные – среды, на которых растут бактерии только одного вида (рода), а род других подавляется. Например, в щелочной пептонной воде и щелочном мясопептонном бульоне интенсивнее по сравнению с другими сопутствующими бактериями растет холерный вибрион. Показателен и пример избирательности питательных сред, содержащих определенные концентрации антибиотиков: на них развиваются только штаммы, обладающие устойчивостью к ним, антибиотикочувствительные культуры в этих средах погибают;
б) дифференциально-диагностические – среды, на которых рост одних видов бактерий отличается от роста других видов по тем или иным свойствам, чаще биохимическим (среды Эндо, Левина, Плоскирева и др.). Кроме того, к дифференциально-диагностическим средам относят и специальные среды, позволяющие определить способность бактерий утилизировать тот или иной субстрат (среды Гиса с углеводами и мясопептонный желатин служат для определения протеолитической активности микроорганизмов; среда Симмонса – для определения способности бактерий разлагать цитрат; среда Хью-Лейфсона используется для дифференцирования аэробных бактерий от факультативно-анаэробных и др.);
в) среды обогащения – среды, в которых происходит размножение и накопление бактерий-возбудителей какого-либо рода или вида, т. е. обогащение ими исследуемого материала (селенитовый бульон).
Для получения чистой культуры необходимо владеть методами выделения чистых культур.
Методы выделения чистых культур
Выделяют следующие методы.
1. Механическое разобщение на поверхности плотной питательной среды (метод штриха обжигом петли, метод разведений в агаре, распределение по поверхности твердой питательной среды шпателем, метод Дригальского).
2. Использование элективных питательных сред.
3. Создание условий, благоприятных для развития одного вида (рода) бактерий (среды обогащения).
Чистую культуру получают в виде колоний – это видимое невооруженным глазом, изолированное скопление бактерий на твердой питательной среде, представляющее собой, как правило, потомство одной клетки. Разные виды бактерий образуют колонии, которые одна от другой отличаются по форме, величине, прозрачности, характеру поверхности, высоте, цвету, консистенции.
Тема 2. Морфология и ультраструктура бактерий
1. Особенности строения бактериальной клетки. Основные органеллы и их функции
Отличия бактерий от других клеток
Выделяют следующие отличия:
1) бактерии относятся к прокариотам, т. е. не имеют обособленного ядра;
2) в клеточной стенке бактерий содержится особый пептидогликан – муреин;
3) в бактериальной клетке отсутствуют аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть, митохондрии;
4) роль митохондрий выполняют мезосомы – инвагинации цитоплазматической мембраны;
5) в бактериальной клетке много рибосом;
6) у бактерий могут быть специальные органеллы движения – жгутики;
7) размеры бактерий колеблются от 0,3–0,5 до 5–10 мкм.
По форме клеток бактерии подразделяются на:
1) шаровидные (кокковые) формы. Кокки имеют правильную сферическую форму или форму неправильного шара в виде почки или напоминают пламя свечи. В среднем кокки в диаметре составляют 0,5–1,5 мкм. В зависимости от взаиморасположения клеток относительно друг друга кокки делятся на микрококки с отдельным изолированным расположением; диплококки – сцепленные попарно; тетракокки – сцепленные по четыре; стрептококки – сцепленные в цепочку; сарцины – сцепленные по 8, 12, 16 и т. д.; стафилококки – сцепленные беспорядочно, внешним вводом напоминая виноградную гроздь;
2) палочковидные (или цилиндрические) формы бактерий. Длина палочки составляет 1–8 мкм, а размер в поперечнике – 0,5–2 мкм. Бактерии различаются по форме и бывают правильной и неправильной, изогнутой, цилиндрической формы; по размерам – мелкие, средние и крупные, причем длина может значительно превышать диаметр поперечника; по форме концов – обрубленные, закругленные, заостренные, утолщенные. Так же как и шаровидные бактерии, палочковидные делятся и по характеру взаиморасположения и бывают расположенными поодиночке, диплобактерии и диплобациллы, сцепленные попарно, а также стрептобактерии и стрептобациллы, сцепленные в цепочку;
3) извитые формы бактерий различаются по характеру и количеству завитков. Среди них различают вибрионы в виде изогнутых палочек или неполных завитков; спириллы с одним или несколькими завитками; спирохеты, которые делятся на лептоспиры – завитки с загнутыми крючкообразными концами (S-образная форма), боррелии – 4–12 неправильных завитков, трепонемы – 14–17 равномерных мелких завитков.
Стоит отметить, что размеры бактерий, так же как и их форма (хотя и реже), могут изменяться, и это происходит под влиянием окружающей среды, в том числе питательной среды, ее рН, температуры, лекарственного препарата и т. п., а также в зависимости от возраста культуры. При этом подобные изменения не наследуются и являются лишь модификациями.
Ультраструктура бактерий изучается с помощью электронно-микроскопических исследований, дифференциального ультрацентрифугирования и цитохимических методов.
В бактериальной клетке различают:
1) обязательные органеллы:
а) нуклеоид – ядерное вещество, распыленное в цитоплазме клетки. Не имеет ядерной мембраны, ядрышек. В нем локализуется ДНК, представленная двухцепочечной спиралью. Обычно замкнута в кольцо и прикреплена к цитоплазматической мембране. Содержит около 60 млн пар оснований. Это чистая ДНК, она не содержит белков гистонов. Их защитную функцию выполняют метилированные азотистые основания. В нуклеоиде закодирована основная генетическая информация, т. е. геном клетки. Наряду с нуклеоидом в цитоплазме могут находиться автономные кольцевые молекулы ДНК с меньшей молекулярной массой – плазмиды. В них также закодирована наследственная информация, но она не является жизненно необходимой для бактериальной клетки;
б) цитоплазму, которая представляет собой сложную коллоидную систему, состоящую из воды (75 %), минеральных соединений, белков, РНК и ДНК, которые входят в состав органелл нуклеоида, рибосом, мезосом, включений;
в) рибосомы, которые представляют собой рибонуклеопротеиновые частицы размером 20 нм, состоящие из двух субъединиц – 30 S и 50 S. Рибосомы отвечают за синтез белка. Перед началом синтеза белка происходит объединение этих субъединиц в одну – 70 S. В отличие от клеток эукариотов рибосомы бактерий не объединены в эндоплазматическую сеть;
г) цитоплазматическую мембрану, которая представляет собой сложный липидобелковый комплекс, располагающийся непосредственно под клеточной стенкой и ограничивающий протопласт клетки. Этот комплекс состоит из липидов (15–30 %), белков (50–70 %), углеводов (2–5 %) и РНК. В цитоплазматической мембране локализуются пермеазы и ферменты окислительного фосфорилирования и регулируется транспорт метаболитов и ионов; происходит выделение ферментов и токсинов; мембрана принимает участие в репликации ДНК нуклеотида и его делении; участвует в синтезе компонентов клеточной стенки, а у некоторых бактерий – и в спорообразовании.
Производными цитоплазматической мембраны клетки являются мезосомы, образующиеся путем ее инвагинации в цитоплазму. Они могут быть в виде концентрических мембран, пузырьков, трубочек, в форме петли. Мезосомы связаны с нуклеоидом и участвуют в делении клетки и спорообразовании;
д) клеточную стенку, которая представляет собой биогетерополимер – плотную структуру, окружающую протопласт клетки и придающую ей постоянную форму;