Радиоиммунологический метод (РИМ), или радиоиммунный анализ (РИА), высокочувствительный метод, основанный на применении радиоизотопной метки антигенов или антител (часто 125I). Обычно используют твердофазовый вариант РИМ, при котором антигены или антитела (в зависимости от задачи исследования) адсорбируются на твердом носителе (целлюлозе, полистироле). Сущность метода заключается в определении количества меченного радиоактивным йодом антигена после его контакта с гомологичными антителами сыворотки. Метод используют для диагностики вирусных гепатитов, бактериальных, риккетсиозных и протозойных заболеваний. Для выявления антигенов ВГВ к исследуемой сыворотке добавляют референс-сыворотку, содержащую антитела к вирусу гепатита В. Cмесь инкубируют 1 2 дня, затем добавляют к ней референс-антиген, меченный изотопом 125I, и продолжают инкубацию еще 24 ч. К образовавшемуся растворимому комплексу антиген антитело добавляют преципитирующие антииммуноглобулины против белка референс-сыворотки, что приводит к образованию преципитата. Результат реакции учитывают по наличию и числу импульсов в преципитате, зарегистрированных счетчиком. При наличии в исследуемой сыворотке антигена, связывающегося со специфическими антителами референс-сыворотки, последние не вступают в связь с меченым антигеном, поэтому он не обнаруживается в преципитате.
Иммуноферментный анализ (ИФА) высокочувствителен, легко воспроизводим и не требует радиоактивных реагентов, что делает его более доступным по сравнению с РИА. Принцип метода состоит в использовании антител, конъюгированных с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой), конъюгатов. Присоединяясь к образовавшимся на твердой фазе иммунным комплексам, конъюгат способствует их выявлению в результате реакции фермента с хромогенным субстратом (ортофенилендиамином, тетраметилбензидином). В качестве твердой фазы используют различные материалы панели для титрования, палочки и шарики, нитроцеллюлозные мембраны. Модификация с использованием мембран получила название ELISA (enzime-linked immunosorbent assay). Результаты анализа учитывают визуально и инструментально (с помощью ИФА-ридеров) по оптической плотности окрашенных продуктов реакции.
Иммуноферментный анализ (ИФА) высокочувствителен, легко воспроизводим и не требует радиоактивных реагентов, что делает его более доступным по сравнению с РИА. Принцип метода состоит в использовании антител, конъюгированных с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой), конъюгатов. Присоединяясь к образовавшимся на твердой фазе иммунным комплексам, конъюгат способствует их выявлению в результате реакции фермента с хромогенным субстратом (ортофенилендиамином, тетраметилбензидином). В качестве твердой фазы используют различные материалы панели для титрования, палочки и шарики, нитроцеллюлозные мембраны. Модификация с использованием мембран получила название ELISA (enzime-linked immunosorbent assay). Результаты анализа учитывают визуально и инструментально (с помощью ИФА-ридеров) по оптической плотности окрашенных продуктов реакции.
Метод широко используют для определения антигенов гепатита В в сыворотке крови, иерсиниозного антигена в кале, моче, слюне.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) молекулярный метод диагностики. Сущность метода заключается в многократном копировании целевого фрагмента ДНК ферментом ДНК-полимеразой. Данный фермент может достраивать короткий участок ДНК, называемый праймером, при условии, что праймер образовал комплекс с другой цепью ДНК. Это возможно, если первичная последовательность праймера соответствует первичной последовательности целевого фрагмента (они комплементарны). Реакция проходит несколько циклов, в результате которых количество точных копий целевого фрагмента увеличивается (амплифицируется) экспоненциально (по крайней мере, в 105 раз) и многократно превышает количество всех остальных продуктов реакции.
Реакция проходит основные этапы:
1) пробоподготовка быстрое, в течение 10 мин, выделение ДНК, готовой к амплификации (свободной от РНК, ингибиторов ДНК-полимеразы, белков), из цельной крови, тканей, суспензий клеточных культур и бактериальных клеток;
2) амплификация;
3) анализ продуктов ПЦР методом электрофореза в геле;
4) документирование результатов электрофореза.
Достоинствами метода являются высокая чувствительность и специфичность, быстрота постановки. С помощью ПЦР можно верифицировать вирусные гепатиты, диагностировать хламидиоз, микоплазмоз, герпетическую инфекцию, корь, краснуху, инфекционный мононуклеоз, дифтерию, ВИЧ-инфекцию и др.
Методы обнаружения специфических антител. Методы серологической диагностики (обнаружение антител в сыворотке крови, ЦСЖ, слюне) широко распространены. Однако они являются методами поздней и ретроспективной диагностики. Для большинства серологических методов необходимо исследование парных сывороток в динамике заболевания с интервалом в 7 14 дней.
Оценка результатов серологического исследования в ряде случаев затруднена. В частности, иммунологический ответ может быть недостаточно напряженным на фоне первичного или вторичного иммунодефицита, а также у детей раннего возраста, особенно недоношенных. Кроме того, у детей раннего возраста могут определяться материнские антитела, у привитых поствакцинальные.