К современным электронно-микроскопическим методам относят просвечивающую, или трансмиссионную электронную микроскопию (ПЭМ), сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) электронную авторадиографию, иммунно-электронную микроскопию, ЭМ-гистохимию.
СЭМ от ПЭМ отличается тем, что в первом электроны не проходят сквозь объект, а отражаются от его поверхности, сканируя ее. Сфокусированный пучок электронов, формируемый электронно-магнитными линзами, следует через отклоняющую катушку, которая перемещает его по поверхности препарата, покрытого тонким слоем металла (золотое или платиновое напыление). С поверхности препарата пучком выбиваются вторичные электроны, которые регистрируются и преобразуются в трехмерное изображение на экране. В отличие от ПЭМ для СЭМ можно использовать коррозийные препараты: объект изучения, например микроциркуляторное русло лимфатических сосудов, заливают какимилибо затвердевающими веществами и после этого просматривают слепки и его поверхности. Изучают также реплики, получаемые путем замораживания скалывания. В этом случае исследуют слепок скола поверхности объекта. Чтобы увеличить контрастность, реплики необходимо оттенить с помощыо напыления частиц металлов (золота, платины) или угля.
Методы качественного и количественного анализа гистологических структур. Качественные гистохимические методы основаны на использовании реакций, с помощыо которых выявляют различные химические вещества в клетках тканей и органов. Зная, как распределяются в тканях белки, жиры, углеводы, ферменты и другие вещества в норме и при различных воздействиях на организм, можно судить с большей или меньшей вероятностью направленности метаболических процессов в исследуемых структурах. Современными гистохимическими методами обнаруживают в клетках аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, определяют активность различных ферментов, например в цикле Кребса. Выявление этих веществ основано на специфичности реакций между химическим реактивом и субстратом, входящим в состав клеточных и тканевых структур, и на выделении продуктов химических реакций в виде окрашенных осадков. Чтобы повысить специфичность реакций, часто применяют метод ферментативного контроля. Например, для выявления ДНК и РНК используют галлоцианин хромовые квасцы, окрашивающие нуклеиновые кислоты в стойкий сине-фиолетовый цвет. ДНК обнаруживают с помощыо реакции Фёльгена. Срезы подвергают кислотному гидролизу (1 н НСl при 60 °C), при этом освобождаются альдегидные группировки дезоксипентозы в ДНК. Затем срезы переносят в фуксинсернистую кислоту, которая взаимодействует только с альдегидными группировками хроматина, обусловливая его пурпурную окраску. Срезы, предварительно обработанные дезоксирибонуклеазой ферментом, расщепляющим ДНК не окрашиваются, что подтверждает наличие в структуре ДНК.
Методами иммуноцитохимии можно идентифицировать клетки различных типов и их рецепторы по маркерным признакам, изучать синтетические и секреторные процессы. Методы основаны на обработке срезов (или мазков) специфическими антителами к выявляемому веществу, которое служит антигеном. Антитела маркируют путем конъюгации с флуоресцентными красителями, ферментами, которые затем выявляются цитохимически или электронно-плотными частицами (ферритин).
С помощью количественных гистохимических методов изучают химический состав конкретных структур клетки.
Цитоспектрофотометрия это метод количественного и качественного изучения веществ по спектру их поглощения в структурах отдельной клетки. С его помощью можно установить суммарное содержание белков или других элементов. В основе метода лежит принцип абсорбционной спектрофотометрии. Например, с помощыо интерферометрии можно оценить сухую массу и концентрацию плотных веществ в живой и фиксированной клетке.
Метод дифференциального центрифугирования основан на применении центрифуг, развивающих скорости от 20000 до 150000 мин и более. При центрифугировании в определенных условиях, например, в сахарозе в зависимости от градиента плотности, удается отделить и осадить различные органеллы клеток: ядра, митохондрии, фракции пиноцитозных и синаптических пузырьков, рибосом и других компонентов, пригодных для гистохимического исследования.
Метод авторадиографии широко применяют для изучения кинетики клеточных популяций, метаболических процессов в клетках, и определения участков синтеза биополимеров с помощью регистрации веществ, меченых изотопами. Для этого в ткань животного или в среду с культивируемыми клетками вводят предшественников какого-либо макромолекулярного соединения (например, аминокислоты, нуклеотиды), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом (например, радиоактивного водорода Н углерода С14, серы, фосфора и других). В процессе синтеза белков, гормонов, ферментов или иных веществ в них включается молекула меченого предшественника. Для регистрации места ее включения в темноте на окрашенные обычными методами срезы наносят специальную мелкозернистую фотоэмульсию, после чего срезы проявляют. На участках соприкосновения фотоэмульсии с радиоактивным веществом происходит фотореакция, в результате которой образуются засвеченные участки метки, или треки. Этим методом можно, например, определить время перемещения клеток, меченых Н3-тимидином в пластах многослойного эпителия, скорость включения меченых аминокислот в белки, синтез йодсодержащих гормонов в щитовидной железе. С помощыо меченого лейцина, радиоактивных предшественников адреналина, норадреналина к серотонина можно определить не только скорость аксонального транспорта от нейронов к клеткам-мишеням, но и установить топографию нервных связей.