Существуют методы получения антител и без использования лабораторных животных. Один из них основан на иммобилизации и включении клеток в твердую матрицу. Второй представляет собой культивирование клеток в гомогенной суспензии. Затруднения в использовании данных технологий возникают в тех случаях, когда иммунизация животных по какой-либо причине невозможна или не удается обойти толерантность к антигену. Для разрешения этой проблемы предложены методы молекулярного клонирования фрагментов генов антител. Одним из таких методов является техника фагового дисплея антител.
2.5. Хранение антител
В зависимости от способа очистки и индивидуальных особенностей конкретных антител транспортировка и хранение осуществляются в одной из следующих форм:
1. Лиофилизированные антитела. Перед первым использованием такие антитела необходимо растворить в буфере, состав которого указан производителем, аликвотировать. Как правило, их хранят при 20 °C, не допуская повторного размораживания. Допускается длительная транспортировка, не требующая особых температурных условий.
2. Концентрированный раствор антител. Обычно это 10 мМ фосфатный буфер (рН 7,2 7,4) или 10 мМ HEPES (pH 7,4 7,5). В буфер добавляют инертный белок, например 1,0 % бычий сывороточный альбумин (BSA), который конкурирует с антителами за места неспецифического связывания на стенках посуды. В качестве криопротектора, защищающего антитела от разрушения при замораживании, используют глицерин (до 50,0 % по массе). В целях предотвращения грибкового и бактериального заражения раствора антител обычно применяют 0,1 % азид натрия. Необходимо обратить внимание на то, что последний является ингибитором пероксидазы! Подбирая антитела, следует тщательно анализировать состав буфера для их хранения. Так, азид натрия можно заменить тимерозалом (до 0,02 %). Иногда в раствор добавляют меркаптоэтанол (до 0,10 %), что необходимо для предотвращения образования дисульфидных связей между субъединицами антител. Перед первым использованием такие антитела также необходимо аликвотировать и хранить при 20 °C (или 70 °C), не допуская повторного размораживания (Boenisch T., 2001).
3. Раствор антител, готовый к употреблению. Этот раствор хранится при температуре 4 8 °C и не требует дальнейшего разведения. Если планируется использовать коммерческие антитела, то необходимо внимательно ознакомиться с прилагаемой к ним инструкцией, в которой указаны условия хранения, оптимальные для поддержания активности антител, и следовать ей.
Литература
Альтшулер E. П., Серебряная Д. В., Катруха А. Г. Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности // Усп. биол. химии. 2010. Т. 50. С. 203 258.
Кеннет Р. Г., Мак-Керн Т. Дж., Бехтол К. Б. Моноклональные антитела: Гибридомы: новый уровень биологического анализа. М.: Медицина, 1983.
Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000.
Тиллиб С. В. Верблюжьи антитела эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии // Мол. биол. 2011. Т. 1. С. 77 85.
Фримел Г. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987.
Atassi M. Z. Molecular Immunology. New York: Marcel Decer, Inc., 1984.
Boenisch T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents // Appl. Immunohistochem. 2001. Vol. 9. P. 176 179.
Burton D. R., Gregory L., Jefferis R. Aspects of the molecular structure of IgG subclasses // Monogr. Allergy. 1986. Vol. 19. P. 7 35.
Haunghton G., Larry W. A., Whitmore A. B-1 cells are made, not born // Immunology Today. 1993. Vol. 14. P. 84 86.
Herschowitz H. I. D. Immunophysiology: Cell function and cellular interactions in antibody formation // Immunology III / Ed. J. A. Bellanti. Philadelphia: Saunders, 1985.
Глава 3.
СПОСОБЫ ВИЗУАЛИЗАЦИИ И УСИЛЕНИЯ ПРОДУКТА РЕАКЦИИ «АНТИГЕН АНТИТЕЛО»
Необходимым этапом любого иммуногистохимического метода является визуализация результатов реакции «антиген антитело». Выявить антитела, связавшиеся с антигеном, можно, используя различные метки, связанные с Fc-фрагментом антител. Такими метками могут быть: флуорохромы, ферменты, металлы и металлопротеины, радиоизотопы, промежуточные связующие вещества, например биотин, дигоксигенин.
Возможно использование меченых антител против интересующего антигена (прямой метод). В этом случае антитела взаимодействуют с антигеном в местах их локализации, последние выявляют при помощи метки, связанной с антителами. Такой метод визуализации наиболее простой, однако его чувствительность крайне низкая, поскольку на одну молекулу искомого антигена будет приходиться одно меченое антитело.
Возможно использование меченых антител против интересующего антигена (прямой метод). В этом случае антитела взаимодействуют с антигеном в местах их локализации, последние выявляют при помощи метки, связанной с антителами. Такой метод визуализации наиболее простой, однако его чувствительность крайне низкая, поскольку на одну молекулу искомого антигена будет приходиться одно меченое антитело.