В настоящее время разработано множество модификаций способа теплового демаскирования антигенов. Общим для них является прогрев срезов, приклеенных к предметным стеклам, в водных растворах до температуры 95 100 °C, а в отдельных случаях и до 120 °C при повышенном давлении.
5.2. Растворы, применяемые для теплового демаскирования антигенов
С учетом эмпирически установленных особенностей процесса демаскирования в качестве растворов могут быть использованы водные растворы солей различных металлов и буферные растворы при различных pH. Считается, что, помимо гидролиза межмолекулярных связей, образованных благодаря действию фиксаторов, эффективность теплового демаскирования зависит от полноты удаления из срезов ионов кальция. Это достигается введением в буферные растворы солей лимонной кислоты или этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, Трилон Б).
Для теплового демаскирования антигенов разработано множество рецептов буферных растворов. В большинстве случаев (если только нет указаний о непригодности этого раствора в аннотации к конкретным антителам) можно применять цитратный буфер (рН = 6,0). По мнению D. J. Dabbs (2006), при отсутствии специального буфера можно использовать дистиллированную воду без добавок. Эффективность демаскирования антигенов в дистиллированной воде ниже, чем при использовании специальных буферных растворов. Наш опыт свидетельствует о том, что при демаскировании антигенов в дистиллированной воде развивается неспецифическое фоновое окрашивание срезов, которое мешает идентификации иммунореактивных структур. Учитывая простоту приготовления цитратного буфера, в общих случаях для демаскирования лучше использовать именно этот раствор.
Как правило, производители первичных антител указывают на необходимость проведения теплового демаскирования для материала, фиксированного в формалине и залитого в парафин, то отмечают, в каком буфере следует производить демаскирование. Наибольшее распространение получили три буферных раствора, применяемых для демаскирования в том случае, когда оно действительно необходимо. Кроме упомянутого цитратного буфера (рН = 6,0), это EDTA-буфер (pH = 8,0) и Tris-EDTA (pH 10,0). Ряд производителей антител рекомендует для обработки свои оригинальные буферные растворы (например, S-1700 (Dako), CC1 и CC2 (Roche-Ventana), Bulls Eye Decloaker (Biocare) и др.). В отдельных случаях эти растворы позволяют добиться лучшего демаскирующего эффекта, чем обычный цитратный буфер (pH = 6,0). Судя по литературе, среди коммерческих буферных растворов наибольшей популярностью у специалистов пользуется модифицированный цитратный буфер с pH = 6,1 (S-1700, Dako).
Одним из недавних усовершенствований технологии теплового демаскирования антигенов является объединение этого этапа обработки препарата с депарафинированием срезов. При этом используются водные растворы детергентов, а не ксилол и аналогичные органические растворители парафина. При прогреве срезов в водных растворах до температуры, близкой к 100 °C, парафин, имеющий сравнительно низкую температуру плавления, уже расплавлен. Трудность заключается в том, чтобы эффективно удалить расплавленный парафин из среза. Для этого в демаскирующий раствор вводятся детергенты. При обработке таким раствором образуется эмульсия парафина в демаскирующем растворе и, соответственно, происходит депарафинирование среза без применения органических растворителей. Наиболее известным коммерческим буферным раствором для одновременного удаления парафина и теплового демаскирования антигенов является раствор Trilogy (CellMarque, США). Метод одновременного удаления парафина и теплового демаскирования антигенов используется в автоматической системе иммуноокрашивания BenchMark (Ventana, США).
Приготовление цитратного буфера. Готовится цитратный буфер (0,01 М, рН = 6,0) следующим образом. Берется 29,4 г цитрата натрия и растворяется в 10 л дистиллированной воды. Затем добавляется 1 н соляная кислота (54 мл). Если pH полученного раствора больше 6, его следует довести до рН = 6, добавляя по каплям 1 % соляную кислоту. Неиспользуемую часть раствора можно хранить в холодильнике в течение недели. Без консерванта раствор нельзя долго хранить.
5.3. Техника теплового демаскирования
Поскольку тепловое демаскирование антигенов требует прогревания срезов в буферных растворах при температуре, близкой к 100 °C, а кипение раствора негативно сказывается на сохранности срезов, были исследованы возможности применения различных приборов для получения высокой температуры без кипения буфера. Оказалось, что для этих целей можно применять водяную баню (95 98 °C), микроволновую печь, пароварку, автоклав, скороварку. В последних двух случаях можно достичь температур выше 100 °C благодаря нагреванию при повышенном давлении. Использование более высоких температур позволяет уменьшить продолжительность процедуры.
5.3. Техника теплового демаскирования
Поскольку тепловое демаскирование антигенов требует прогревания срезов в буферных растворах при температуре, близкой к 100 °C, а кипение раствора негативно сказывается на сохранности срезов, были исследованы возможности применения различных приборов для получения высокой температуры без кипения буфера. Оказалось, что для этих целей можно применять водяную баню (95 98 °C), микроволновую печь, пароварку, автоклав, скороварку. В последних двух случаях можно достичь температур выше 100 °C благодаря нагреванию при повышенном давлении. Использование более высоких температур позволяет уменьшить продолжительность процедуры.