Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии
УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АТ-пара пара нуклеотидов аденин тимин
АТФаза аденозинтрифосфатаза
ГАМК гамма-аминомасляная кислота
ГДК глутаматдекарбоксилаза
ГЦ-пара пара нуклеотидов гуанин цитозин
дцДНК двухцепочечная
ДНК ММ молекулярная масса
НК нуклеиновые кислоты
оцДНК одноцепочечная
ДНК ПЦР полимеразная цепная реакция
РНК рибонуклеиновая кислота
СФ синаптофизин
ФСБ фосфатно-солевой буфер
ФЭУ фотоэлектронный умножитель
ЦПМ цитоплазматическая мембрана
ЭПР эндоплазматический ретикулум
ЭФР эпидермальный фактор роста
5-TAMRA 5-carboxytetramethylrhodamine
CCD-матрица (ПЗС-матрица) charge-coupled device (прибор с зарядовой связью)
DABCO диазобициклооктан
DAPI 4,6-диамидино-2-фенилиндол
DMD digital micromirror device (цифровые микрозеркальные устройства)
EB этидия бромид
FITC флуоресцеинизотиоцианат
FLAP Fluorescence Localization After Photobleaching (локализация флуоресценции после фотоотбеливания)
FLIM fluorescence lifetime imaging microscopy (микроскопия для исследования времени жизни флуоресценции)
FLIP Fluorescence Lossin Photobleaching (потеря флуоресценции во время фотоотбеливания)
FRAP Fluorescence Recovery After Photobleachin (восстановление флуоресценции после фотоотбеливания)
FRET Fдrster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (Фёрстеровская (флуоресцентная) резонансная передача энергии)
GPDH глицерофосфатдегидрогеназа
LDH лактатдегидрогеназа
PBFI potassium-binding benzofuran isophtalate
PPI пропидия йодид
PPDA парафенилендиамин
RITC родаминизотиоцианат
SBFI sodium-binding benzofuran isophtalate
SDS додецилсульфат натрия
SHIM Second-harmonic imaging microscopy (микроскопия с использованием регистрации второй гармоники)
SNAP25 Sy Naptosomal-Associated Protein, 25 kD
SNARE Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein Receptor
TRITC тетраметилродамин-5(6) изотиоцианат
ПРЕДИСЛОВИЕ
В последние годы благодаря достижениям квантовой физики, молекулярной биологии и иммуноцитохимии, классические морфологические дисциплины приобрели совершенный инструмент для молекулярного анализа клеточных и тканевых структур. Сейчас можно констатировать, что на основе всестороннего использования новых молекулярных подходов происходит выделение передового направления в морфологии молекулярной морфологии. Молекулярная морфология, аккумулируя знания, накопленные классической гистологией, эмбриологией, и патологической анатомией, способна занять ключевое место в интеграции клеточной биологии, биохимии, физиологии, молекулярной генетики и протеомики при решении фундаментальных проблем и прикладных задач биомедицинских исследований. Молекулярная морфология, используя постоянно расширяющиеся возможности новых методов конфокальной микроскопии, а также оптической микроскопии сверхвысокого разрешения, в скором времени должна решить насущную задачу создания нового поколения методов трехмерного молекулярного анализа клеточных и тканевых структур, пригодных для использования не только в практике научного исследования, но и в диагностических целях. Ожидаемые новые методы должны быть просты, надежны в использовании, высокоселективны и высокочувствительны. Успешное решение поставленной задачи требует от исследователя глубоких знаний о современных методических приемах иммуноцитохимии, флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии. Одной из важных задач, стоящих перед морфологом, занимающимся научными исследованиями, является участие в комплексных исследовательских программах, объединяющих специалистов разного профиля с целью решения конкретной научной проблемы. Квалифицированному специалисту-морфологу для успешного выполнения задач комплексных междисциплинарных исследований уже недостаточно владения только основами общей, частной морфологии и патологии, но требуется также и понимание главных биофизических принципов, лежащих в основе феноменов, используемых при создании приборов, предназначенных для флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии. Без этого невозможно разобраться в сложных настройках современных приборов, от правильного использования которых зависит окончательный результат кропотливой подготовительной работы. Облегчить специалистам-морфологам и научным работникам смежных специальностей знакомство с новыми методами микроскопии и показать, как можно с их помощью решать различные задачи, связанные с изучением структур клеток и тканей, должна помочь настоящая книга.
Технической базой для реализации представленных в приложениях протоколов и иллюстраций, помещенных на вклейках, послужил комплекс оборудования и программного обеспечения, разработанный фирмой Zeiss (Германия), который включает конфокальные лазерные микроскопы LSM 710 и LSM 510 Meta. Иммуноцитохимические протоколы и общие принципы работы с конфокальным микроскопом универсальны и могут успешно использоваться с оборудованием любых производителей.
Настоящее руководство аккумулирует многолетний опыт сотрудников лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии Института экспериментальной медицины, связанный с использованием методов конфокальной лазерной микроскопии и иммуноцитохимии.