Цинк-формалиновый фиксатор с сульфатом цинка (Kiernan J. A., 2008). Для приготовления фиксатора берут 900 мл дистиллированной воды, 100 мл концентрированного раствора формальдегида и 10 г сульфата цинка (ZnSO44··7H2O). Считается, что лучший результат фиксации антигенов получается при pH = 4,0 6,5. Если pH приготовленного раствора выходит за указанные границы, следует использовать 1 М растворы HCl и NaOH, которые добавляют к раствору фиксатора по каплям до необходимого уровня pH. Цинк-формалиновый фиксатор с сульфатом цинка может быть использован для перфузионной фиксации лабораторных животных. Для иммерсионной фиксации небольших объектов достаточно 6 8 ч. Объекты можно оставить в фиксаторе на срок до 1 нед. После фиксации в цинк-формалине можно заливать объекты в парафин (после промывки в воде), изготовлять срезы незалитого материала на замораживающем микротоме и криостате.
Раствор параформальдегида с пикриновой кислотой, по Замбони. Первоначально этот фиксатор был предложен (Zamboni L. [et al.], 1967) для электронной микроскопии. Способ приготовления: 20 г параформальдегида растворяют в насыщенном водном растворе пикриновой кислоты (150 мл). Раствор нагревают до 60 °C. Для улучшения растворения параформальдегида необходимо добавить в раствор 2 5 капель 1 М (4 %) водного раствора NaOH. После растворения параформальдегида раствор фильтруют, охлаждают и доводят до 1 л при помощи фосфатного буфера.
Приготовленный фиксирующий раствор стабилен в течение 12 мес. Особенно его рекомендуют для фиксации препаратов головного мозга и почки (Kiernan J. A., 2008). Время фиксации составляет 8 24 ч. По окончании фиксации рекомендуется промывка в воде, после чего для обезвоживания используют 70 %-й этанол.
Фосфатный буфер Замбони. Способ приготовления: однозамещенный фосфат натрия (NaH2PO44··H2O) 3,31 г, двузамещенный фосфат натрия безводный (Na2HPO4) 17,89 г, дистиллированная вода до 1 л.
Цинк-этанол-формальдегид (Kоржевский Д. Э. [и др.], 2006). Способ приготовления: для приготовления 1 л фиксатора берут 900 мл 96 %-го этанола, 100 мл концентрированного раствора формальдегида и 10 г хлорида цинка. Готовый раствор сохраняет свои свойства в течение 4 5 нед. Продолжительность фиксации составляет 18 24 ч. Поскольку одновременно с фиксацией материала происходит его обезвоживание, после завершения фиксации кусочки перекладывают сразу в 96 %-й этанол. Этот фиксатор рекомендован для обработки головного и спинного мозга, поскольку наряду с улучшением сохранности тканевых антигенов обеспечивает высокое качество окраски по Нисслю.
1. Аничков Н. М., Данилова И. А., Васильев О. Д. [и др.]. Применение раствора полигуанидина для фиксации биологических и анатомических объектов // Морфология. 2010. Т. 137, 1. С. 58 61.
2. Арасланов С. А., Зайцев В. Б., Мешандин А. Г. [и др.]. Новый фиксатор биологического материала // Морфология. 2007. Т. 131, 1. С. 79 81.
3. Артишевский А. А., Леонтюк А. С., Слука Б. А. Гистология с техникой гистологических исследований. Минск: Вышэйшая школа, 1999. 236 с.
4. Вайль С. С. Практическое руководство по патолого-гистологической технике. Л.; М.: ОГИЗ, 1934. 228 с.
5. Коржевский Д. Э., Гиляров А. В. Основы гистологической техники. СПб.: СпецЛит, 2010. 96 с.
6. Коржевский Д. Э., Григорьев И. П., Отеллин В. А. Применение обезвоживающих фиксаторов, содержащих соли цинка, в нейрогистологических исследованиях // Морфология. 2006. Т. 129, 1. С. 85 86.
7. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969. 643 с.
8. Меркулов Г. А. Курс патогистологической техники. Л.: Медицина, 1969. 423 с.
9. Ромейс Б. Микроскопическая техника: пер. с нем. М.: Изд-во иностр. литер., 1954. 718 с.
10. Bancroft J. D., Gamble M. Theory and practice of histological techniques. Edinbugh; London; N. Y.: Churchill Livingstone, 2002. 796 p.
11. Kiernan J. A. Histological and histochemical methods. Theory and practice. London: Scion Publishing Ltd, 2008. 606 p.
12. Naish S. J. Immunochemical staining methods. Glostrup: DAKO Corporation, 1989. 41 p.
13. Zamboni L., DeMartino C. Buered picric acid formaldehyde: a new rapid xative for electron microscopy // J. Cell Biol. 1967. Vol. 35. P. 148A.
Глава 2
ДЕКАЛЬЦИНАЦИЯ КОСТНОЙ ТКАНИ
2.1. Общие сведения о декальцинации
Для изучения гистологических препаратов плотных кальцифицированных тканей могут быть изготовлены шлифы, которые позволяют сохранить минеральные компоненты, придающие тканям высокую плотность. Однако эта процедура трудоемка и требует специального оборудования. На обычном микротоме невозможно изготовить срезы недекальцинированной костной ткани. Перед заливкой таких объектов в парафин или целлоидин производят декальцинацию, в ходе которой из объекта удаляются соли кальция, он теряет свою плотность и становится пригодным для последующей микротомии. Как правило, декальцинацию проводят после полной фиксации ткани. Однако существуют методы, благодаря которым декальцинация начинается одновременно с фиксацией. В этом случае фиксирующая среда должна содержать декальцинирующее вещество. После декальцинации в кислотах желательна тщательная промывка материала в слабощелочных растворах на протяжении 1 3 ч.