Сочетание этанола с формальдегидом. Существует несколько вариантов прописи фиксатора, состоящего из этанола и формалина (или параформальдегида). Чаще всего используют 5 10 %-й раствор формалина на основе спирта различной крепости (от 70 %-го до абсолютного). Для иммуноцитохимических исследований рекомендуется использовать 1 2 %-й раствор формалина (или 0,5 0,7 %-й раствор параформальдегида) на 80 %-м этаноле.
Для приготовления 100 мл фиксатора берут 98 мл 80 %-го этанола и 2 мл концентрированного формальдегида. Если используется сухой параформальдегид, фиксатор удобнее готовить следующим образом. Заранее готовится 4,0 %-й водный раствор параформальдегида, который может длительно сохраняться. Для этого параформальдегид растворяют в дистиллированной воде при нагревании (проще всего закрытую емкость оставить в термостате при 37 или 56 °C на 1 3 сут, несколько раз перемешивая раствор в течение дня). На каждые 80 мл 96 %-го этанола добавляют по 15 мл полученного водного раствора параформальдегида.
Продолжительность фиксации для иммуноцитохимии 18 24 ч, для обычных окрасок до 48 ч при комнатной температуре. После фиксации материал в воде не промывают. Обезвоживание можно начинать с 90 96 %-го спирта (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).
Абсолютный спирт с добавлением ледяной уксусной кислоты (например, 20 мл кислоты на 100 мл спирта) быстро проникает в ткани, так что в нем могут профиксироваться за несколько часов и кусочки несколько более крупные, чем в абсолютном спирте. Способ употребления и результаты сходны с теми, которые характерны при использовании абсолютного спирта. После фиксации материал переносят еще на короткий срок в чистый абсолютный спирт. Затем следует заливка (Ромейс Б., 1954).
Жидкость Карнуа. Эта фиксирующая жидкость хорошо сохраняет структуру ядра клетки и часто применяется при необходимости быстрой фиксации и ускоренной проводки. Фиксатор готовится менее чем за 1 ч до начала фиксации. Фиксатор состоит из абсолютного спирта (можно заменить и 96 %-м), хлороформа и ледяной уксусной кислоты в соотношениях 6: 3: 1. При фиксации в жидкости Карнуа следует вырезать кусочки толщиной не более 4 мм. Продолжительность фиксации составляет 3 4 ч. Длительное пребывание объектов в фиксаторе в большинстве случаев нежелательно. После жидкости Карнуа материал обезвоживают в абсолютном этаноле, после чего можно сразу приступать к заливке. В случае необходимости после фиксации и обезвоживания материал можно длительно хранить в метилсалицилате (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).
Спирт-цинковый фиксатор по Рейману и Унна (1912) состоит из 2 % раствора хлористого цинка в 96 %-м этаноле. Этот фиксатор Б. Ромейс рекомендует для лучшего выявления цитоплазмы клеток.
Этанол-уксусная кислота. Смесь 96 %-го этанола с ледяной уксусной кислотой в соотношении 3: 1 в англоязычной литературе иногда называют жидкостью Карнуа I, а обычную жидкость Карнуа Карнуа II. Условия фиксации материала аналогичны условиям фиксации в жидкости Карнуа.
Спирт-формалин-уксусная кислота (СФУ). Существует несколько вариантов фиксирующих растворов, в которые входят помимо этанола формалин и ледяная уксусная кислота. Все они считаются (Лилли Р., 1969) хорошими фиксаторами для цитоплазматических структур и являются оптимальными для стабилизации гликогена в тканях. Фиксирующие растворы готовятся в день взятия материала, поскольку их качество изменяется с течением времени. СФУ по Лилли состоит из 85 мл 96 %-го этанола, 10 мл концентрированного (35 40 %) формальдегида и 5 мл ледяной уксусной кислоты. Для лучшей стабилизации гликогена рекомендуется фиксировать материал при 0 5 °C в течение 24 ч. После фиксациидальнейшую проводку можно начинать с 96 %-го этанола. СФУ по Теллесницкому готовится из 100 мл 70 %-го этилового спирта, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 5 мл концентрированного формальдегида. Продолжительность фиксации объектов 18 24 ч. После фиксации проводку следует начинать с 80 %-го этанола. В нем объекты могут быть оставлены и для длительного хранения, поскольку тинкториальные свойства не изменяются.
1.2.4. Метанол
Метанол является высокотоксичным соединением и поэтому редко используется в гистологической практике. Однако абсолютный метанол является лучшим фиксатором для мазков крови и красного костного мозга. Традиционно его рекомендуют и для фиксации других цитологических объектов. Фиксацию мазков в метаноле осуществляют следующим образом: в герметично закрытый стакан с абсолютным метанолом помещают предметные стекла с мазками на 5 10 мин, затем их извлекают и просушивают (Артишевский А. А. [и др.], 1999).
Метанол-уксусная кислота. В последнее время большое распространение получил фиксатор, состоящий из метанола и уксусной кислоты в соотношении 3: 1 (мета-Карнуа). Он рекомендован для фиксации объектов, в которых планируется выявлять аргентофильные белки ядрышкового организатора (Ag-NOR). Сроки фиксации аналогичны срокам, рекомендованным для жидкости Карнуа (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).
Р. Лилли (1969) приводит сведения о фиксаторе метанолхлороформ (2: 1; время фиксации 12 48 ч), который рекомендуется для экстракции липидов из нервной ткани при комбинированной заливке в целлоидин-парафин. При использовании метанол-хлороформа возможно получение срезов толщиной 2 мкм.