Раздел I
ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 1
ФИКСАЦИЯ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
1.1. Общие положения
Фиксация один из ключевых этапов гистологического исследования, от которого во многом зависит качество получаемого препарата. Фиксированный не по правилам или недофиксированный препарат, как правило, непригоден для микроскопического анализа, поэтому необходимо тщательно соблюдать правила фиксации и регулярно контролировать качество реагентов, используемых для приготовления фиксирующих растворов.
Фиксация обеспечивает стабилизацию и уплотнение тканевых структур. Выбор фиксирующей среды зависит от задач исследования. Объем фиксирующей жидкости должен превышать объем кусочков не менее чем в 10 раз. Кусочки в растворе не должны слипаться и скапливаться на дне банки. В большинстве случаев (если нет особых указаний) фиксацию следует проводить при комнатной температуре, поскольку охлаждение раствора ведет к замедлению процесса фиксации, а подогрев к быстрому развитию аутолиза в центральной части фиксируемого объекта (той области, в которую не успел проникнуть фиксатор).
Важным моментом является правильное иссечение объектов, предназначенных для фиксации и дальнейшего гистологического исследования. Кусочки органов следует вырезать острым ножом или бритвой. Не рекомендуется пользоваться ножницами во избежание травмирования объектов. Нельзя сдавливать кусочки, скоблить или протирать их поверхность, особенно слизистую и серозную оболочки.
Для микроскопического исследования вырезают кусочки органов толщиной 0,5 1,0 см. Длина и ширина могут быть различными (обычно 1,0 × 1,5 см). При этом стараются сформировать объект с таким расчетом, чтобы получаемый срез поместился на стандартное предметное стекло. Ввиду медленного проникновения фиксатора в глубину ткани не рекомендуется брать для исследования более толстые кусочки. Кусочки сразу же помещают в фиксирующую жидкость. Недопустимо обмывание кусочков водой перед фиксацией (это может привести к удалению объектов, имеющих диагностическое значение, и появлению артефактов).
1.2. Фиксация материала для световой микроскопии
Световая микроскопия микроскопия в проходящем свете видимого спектрального диапазона с использованием способности различных компонентов гистологического препарата к селективному восприятию биологических красителей. Для того чтобы структуры, наблюдаемые в микроскоп, хорошо сохранялись при обработке иссеченного материала, необходимо сделать их устойчивыми к действию применяемых при проводке и окраске химических реагентов. Подобная устойчивость структур, а также уплотнение материала достигаются в ходе фиксации. Фиксация необходима и для максимального сохранения внутриклеточных и тканевых взаимоотношений, только при этом условии можно получить информативные препараты для диагностических и исследовательских целей.
Существуют физические и химические способы фиксации. К первым относятся действие высокой температуры и влияние электромагнитного излучения в сверхвысокочастотном диапазоне (микроволновая фиксация). В настоящее время высокотемпературная фиксация применяется редко. По С. С. Вайлю, кусочки нефиксированной ткани помещают в кипящую воду на 1 3 мин, после чего переносят в 90 100 %-й этанол и после обезвоживания заливают в парафин. Р. Лилли (1969) рекомендует использовать для варки изотонический раствор хлорида натрия (0,85 0,90 %) и изготавливать срезы на замораживающем микротоме без заливки. В этом случае препарат можно получить через несколько минут после доставки срочной биопсии. К возникающим артефактам относят сильное сморщивание тканей и разрушение нежных структурных образований (Вайль С. С., 1934).
Микроволновая фиксация осуществляется при помощи современных лабораторных установок, позволяющих контролировать температуру обрабатываемого объекта. Преимущество этого метода перед другими способами фиксации состоит в мгновенном проникновении фиксирующего фактора во все части объекта. Экспериментальными исследованиями установлено, что оптимальная температура при микроволновой фиксации составляет 45 55 °C. Перегрев объекта до температур выше 65 °C ведет к появлению артефактной вакуолизации цитоплазмы и пикнотизации ядер клеток. Данный метод фиксации рекомендован при проведении срочных биопсий (Bancroft J. D. [et al.], 2002).
Химические методы фиксации основаны на влиянии на тканевые структуры различных химических веществ (спиртов, альдегидов, кетонов, кислот, солей), которые, проникая в фиксируемый материал, вызывают многообразные физико-химические процессы, приводящие к стабилизации его структуры. Различают простые и сложные (составные) фиксаторы. К первым могут быть отнесены ацетон, этанол, метанол, формалин, тетраоксид осмия. Вторая группа намного более разнообразна и включает сотни различных составных фиксирующих растворов, обладающих различными преимуществами и недостатками.
1.2.1. Ацетон
Ацетон как самостоятельное фиксирующее вещество редко применяется в гистологии из-за сильного сжатия фиксируемого материала. Тем не менее его нередко используют для фиксации цитологических мазков и криостатных срезов, выполненных из нефиксированного материала. Считается, что кратковременная фиксация ацетоном (15 мин) позволяет сохранить часть антигенов, которые разрушаются при других способах фиксации и последующей заливке объектов в парафин. По мнению Б. Ромейса (1954), фиксация чистым ацетоном имеет смысл лишь при необходимости быстрого получения гистологического препарата. Для этого кусочки органов толщиной 1 3 мм помещают на 1 3 ч в безводный ацетон, переносят на 30 мин в ацетон-бензол (1: 1), затем на 30 60 мин в бензол и заливают в парафин. Непосредственный перенос объектов из ацетона в парафин нежелателен, так как последний почти нерастворим в ацетоне.