Всего за 364.9 руб. Купить полную версию
Далее клетки переносят в культуральные флаконы (Рис. 7а и 7б), содержащие питательную ростовую среду. Ростовая среда содержит набор аминокислот, глюкозу и др. питательные вещества для клеток и 1020% эмбриональной телячьей сыворотки (плазма крови), содержащей необходимые ростовые факторы, обеспечивающие деление клеток. Сами флаконы помещают в СО2-инкубатор. Флаконы закрывают не плотно, а так, чтобы воздух с повышенным содержанием углекислого газа из инкубатора мог поступать внутрь флаконов. Можно использовать также флаконы с вентилируемыми крышками (с встроенным стерильным фильтром) через которые предусмотрен воздухообмен с воздухом в инкубаторе. Этим способом обеспечиваются условия для роста (деления) клеток.
Все работы проводятся в строго стерильных условиях в ламинарном шкафу (Рис. 8а и 8б), в который вентилятором через стерилизующий воздушный фильтр, расположенный сзади или сверху шкафа, под небольшим давлением нагнетается стерильный (очищенный от бактерий) воздух. За счет избыточного давления внутри ламинарного шкафа внешний воздух с бактериями внутрь не проникает, поэтому культуры клеток остаются стерильными. Работа внутри шкафа осуществляется высококвалифицированным специалистом с использованием стерильной лабораторной посуды, в том числе флаконов, пипеток, чашек Петри и др. Дополнительная стерильность осуществляется за счет обжига поверхностей посуды (горлышка флаконов, рабочих частей пипеток) в пламени спиртовой или газовой горелки, которая установлена внутри ламинарного шкафа и включена постоянно в течение всего времени работы с биологическим материалом. Сам специалист находится вне шкафа, но все действия осуществляет руками в стерильных хирургических перчатках внутри ламинарного шкафа через открытую нишу, из которой постоянно выходит стерильный воздух, не позволяющий поступать внутрь нестерильному воздуху (с бактериями) извне.
Полученные от пациентов культуры клеток используют для наработки необходимого количества клеток, достаточного для процедур (68 пассажей или делений клеток в культуре). Далее фибробласты тестируются на отсутствие контаминации (заражения) ВИЧ, гепатитов А, В и С, микоплазмы и хламидий. Тестирование проводится при помощи ПЦР (полимеразная цепная реакция) и иммуноферментными методами. Отсутствие онкогенных потенций клеток определяют на бестимусных (без иммунитета) мышах. Далее монослойные культуры клеток снимают с поверхности флаконов смесью растворов Версена и трипсина и суспендируют (перемешивают) с применением серологических пипеток в стерильном физиологическом растворе для инъекций. Затем 23 раза центрифугируют и отмывают клетки от Версена и трипсина в таком же физрастворе. Готовые суспензии сохраняют при +40С. Препараты клеток используют в течение 24 часов после получения суспензии.
Жизнеспособность клеток в суспензии определяют с помощью высевания суспензионной культуры через различные сроки инкубации и подсчета количества прикрепившихся клеток, по их способности к образованию колоний.
Процедура клеточной терапии
Процедуру введения клеток пациенту проводят методом туннельных инъекций для крупных морщин или обкалыванием мелких морщин. Количество клеток в препаратах варьирует в зависимости от процедуры, объем введенного препарата составляет в среднем 13 мл на процедуру. Количество вводимых клеток составляет в среднем от 1 до 10 млн.
Метод введения клеток показан на рис. 9а и 9б. Клетки вводятся с помощью инсулинового шприца в дермальный (средний) слой кожи (Згурский, 2004). Игла инсулинового шприца очень тонкая, поэтому процедура вызывает минимально неприятные ощущения.
Поверхность кожи, в которую вводятся клетки, обрабатывается стерилизующими растворами перед выполнением процедур, а все манипуляции исполнитель делает строго в стерильных резиновых перчатках и в марлевой повязке, закрывающей дыхательные органы.
Результаты применения аутогенных
фибробластов
По мнению одного из ведущих специалистов в области применения аутогенных фибробластов кандидата биологических наук А. А. Згурского (Згурский, 2004) процедура имеет несколько привлекательных моментов для косметолога и, соответственно, для пациента: