По дороге в Швецию в 1579 г. Поссевино остановился в Вильно, где впервые встретился с польским королем Стефаном Баторием и где состоялся его диспут с кальвинистом Андреем Воланом. Под влиянием аргументов Поссевино Баторий приказал Волану уничтожить свое сочинение. В том же году, будучи уже в Швеции, иезуит написал обширное полемическое сочинение против лютеранина Давида Хитрея. С 1580 г. Поссевино находился в Риме, где его застало посольство Шевригина (24 февраля 1581 г.).
Папская курия дает подробные инструкции иезуиту. Основная цель миссии Поссевинопривлечь Ивана IV к антиосманской лиге и этим приблизить его к папскому двору, затем постепенно обратить русского царя в католичество и подготовить почву для полного окатоличивания России. Перед отъездом Поссевино знакомится с доступными ему материалами о России: книгами Герберштейна, Гваньини, Кобенцеля, Джовио, Кампензе, письмами и инструкциями пап Льва X, Климента VII, Пия V и Григория XIII, стремившихся завязать дипломатические связи с Россией.
27 марта 1581 г. русское посольство вместе с Поссевино выехало из Рима. Первая, довольно длительная остановка, была в Венеции. Здесь Поссевино вел переговоры о вовлечении Венецианской республики в антитурецкую лигу и о возможных торговых отношениях Венеции с Россией. В Австрии, Богемии, Речи Посполитой Поссевино знакомится с положением дел, регулярно отсылая донесения в Рим. В Граце (Штирия) Поссевино встречается с Кобенцелем, недавно побывавшим в России в качестве посла императора Максимилиана, и имеет с ним продолжительную беседу о положении дел в России.
13 июня Поссевино прибыл в Вильно к польскому королю. Баторий сначала с неудовольствием принйл посредничество иезуита, считая, что переговоры дадут передышку «московиту» и позволят ему стянуть новые силы в западные области. Но Поссевино увлек Батория картиной той исторической роли, которую ему будет суждено сыграть; заключив мир с Иваном IV, Баторий подготовит почву для объединения восточной и западной церкви и будет содействовать распространению католичества в северных и восточных областях. Этим же он обеспечит себе поддержку папского престола. 3 июля Поссевино вместе с канцлером Яном Замойским прибыл в Диену. Здесь, как и в Вильно, Поссевино всячески старался использовать свое влияние на короля, постоянно беседуя с ним и почти ежедневно произнося проповеди. Он добился у короля разрешения конфисковать в пользу иезуитской коллегии, основанной в Вильно в 1579 г., часть имений, принадлежавших ранее русской церкви.
18 августа Поссевино приехал в Старицу (через Оршу и Смоленск), где в это время находился Грозный. Здесь Поссевино вручил царю письма папы и императора Рудольфа, а также подарки и письма к царице (ошибочно названной в письме Анастасией) и царевичам. Здесь Поссевино узнал условия Ивана IV: царь отдает Полоцк с пригородами, Луки, Заволочье, себе же требует 36 замков в Ливонии, в их числе Нарву с пригородами. Иезуиту при этом были показаны некоторые документы из архивов, подтверждавшие права русских на Ливонию. Поссевино пробыл в Старице около месяца. Грозный несколько раз принимал его, и всякий раз Поссевино пытался начать разговор с ним о вере и объединении церквей, от чего царь упорно уклонялся.
14 сентября Поссевино отправился из Старицы в польский лагерь под Псковом. У царя были оставлены иезуиты Дреноцкий и Мориено, которым была дана строгая инструкция следить за московскими делами, не раздражать царя и русских, стараться встречаться с приближенными московского князя, беседовать с ними о вере. Эта инструкция оказалась лишней, так как иезуитов держали почти в полной изоляции, и даже письма Поссевино не всегда доходили до них.
К концу сентября относится окончание 1-й части (комментария) «Московии» в виде письма к Григорию XIII от 29 сентября 1581 г. Письмо вместе с записью бесед с царем было отправлено в Рим со спутником Поссевино Паоло Кампани. Эти записи, а также копии архивных документов о Ливонии, по утверждению Пирлинга, позже были утеряны.
5 октября Поссевино приехал в польский лагерь под Псковом. Положение поляков к этому времени резко ухудшилось. Стойкая оборона защитников Пскова, отсутствие средств на продолжение длительной осады и внутренние раздоры в польском лагере вызывали недовольство у самих осаждающих. «Провиант добываем за 12 миль от лагеря, да и то с большой опасностью. Русские захватывают лошадей, провиант и все прочее... солдаты дезертируют от холода, босые, без шапок и платья, страшно дерутся с жолнерами из-за дров, которые привозят в лагерь, отнимают друг у друга платье и обувь, затем жалобы и ропот на все... воровство в лагере страшнейшее»,свидетельствует один из участников осады. Тем не менее требования Грозного показались Баторию чрезмерными, и он не захотел вести переговоры на таких условиях. Поссевино тотчас отправил царю очень красноречивое письмо, где рисовал положение русских самыми мрачными красками: «... в городе (Пскове) очень многие погибают от обстрела королевских пушек, от болезней и душевной скорби, подобно тому, как и в деревнях многие испытали на себе меч врага... король Стефан решил зимовать и вести военные действия повсюду в Московии и остальных своих владениях. Кроме того, он приказал подвезти из Риги большое количество пороха и ядер и вот уже четвертый день ждет пополнения из иностранных солдат...». Поссевино писал также, что шведский король взял Ивангород и Нарву и, следовательно, может вторгнуться в пределы Московии. Уступка Ливонии, убеждал иезуит, не будет особенно тяжелой для русской стороны, так как он обещает испросить у польского короля право свободного проезда через ливонские земли для послов и купцов. Вероятно, под влиянием этого письма в наказе своим послам Дмитрию Елецкому «со товарыщи» русский царь выдвинул более умеренные и невыгодные для русских требования: он соглашался передать польской стороне всю Ливонию, оставив за собой Великие Луки, Невель, Заволочье, Холм и псковские пригороды. Послам также было предписано не поднимать вопроса о Нарве и «свейского не замиривати».
Поссевино вместе с польскими послами выехал из псковского лагеря в Ям Запольский, где была назначена встреча послов. Переговоры начались 13 декабря в деревне Киверова Горка в нескольких километрах от Яма Запольского (между Заволочьем и Порховом) и продолжались больше месяца (до 15 января 1582 г.). Поссевино проявлял при этом большую активность: вел все заседания, писал протоколы, обменивался письмами с русским царем, польским королем, канцлером Замойским, кардиналом ди Комо, шведским королем и другими, снимал копии со всех документов. Переговоры велись медленно. Несколько раз польские послы в раздражении на неуступчивость русских уходили с заседаний, заявляя, что больше не вернутся. Поссевино старался примирить враждующие стороны и ускорить ход переговоров. Полякам советовал прекратить осаду Пскова, так как это затрудняет перемирие. Говорил о стойкости русских при защите своих крепостей, приводя в пример безуспешную осаду Печерского монастыря войсками Батория.
В то же время в письмах к Грозному он писал о бедственном положении русских: «Храмы разрушены или обращены в конюшни... трупы взрослых и детей валяются повсюду, и на дорогах их топчут копыта коней. Происходит много убийств и грабежей мирных сельских жителей, на них охотятся с величайшим азартом в лесах, забыв об охоте на диких зверей. На обширных пространствах видны следы пожаров и невероятного опустошения твоих владений. Впрочем, это везде не имеет значения, так как там не осталось ни земледельцев, ни скота, однако это на многие годы затруднит торговлю иноземных людей с твоими». Такая политика Поссевино вызвала недовольство обеих сторон. Замойский в раздражении говорил о нем: «Такого сварливого человека я не видывал, он хотел бы знать все королевские планы относительно заключения мира с московским царем, он втирался в королевский совет, когда обсуждалась наша инструкция послам. Он готов присягнуть, что великий князь к нему расположен и в угоду ему примет латинскую веру, и я уверен, что эти переговоры кончатся тем, что князь ударит его костылем и прогонит». Русские же послы писали: «А нам, холопем твоим, видетца, что Онтоней во всех делах с литовские послы стоит за один и в приговорах во всяких говорит в королеву сторону и грамоты твои, государевы, послам кажет». В ходе переговоров обе стороны старались узнать, до каких пределов послам даны полномочия уступать. Поссевино предложил польским послам первым сделать уступки и этим вызвать на откровенность русских. Такой тактический ход продвинул немного вперед переговоры. Поссевино советовал польскому королю выдавать себя за союзника шведского короля Юхана III с тем, чтобы казаться московским послам более серьезным противником. Вопрос о том, включать ли шведского короля в перемирие, долго обсуждался на заседаниях. По совету иезуита, переговоры с Юханом III были на время отложены, при этом Поссевино надеялся, что и для заключения мира со шведами московский царь выберет его своим посредником.