Создание букардо
Перенос клеточного ядра – это сложный процесс, на каждом этапе которого ученых подстерегает провал. Даже самые простые на первый взгляд шаги могут сопровождаться существенными проблемами. К примеру, в случае собак практически невозможно получить созревшие яйцеклетки, в которые будет произведен перенос генетического материала из соматических клеток. В отличие от яйцеклеток других животных, созревающих в яичниках, яйцеклетки собак созревают по мере продвижения из яичника в матку. Поскольку овуляторный цикл у домашних собак тоже, как правило, непредсказуем, для того, чтобы понять, в какой момент нужно забирать созревшие яйцеклетки, понадобится не только внимательное наблюдение за гормональным фоном животного, но и капля везения.
Однако наиболее тяжелый этап ядерного переноса – перепрограммирование. Во время перепрограммирования клетка забывает, каково это – быть соматической клеткой, и превращается, в сущности, в эмбриональную стволовую клетку. Только полностью перезагруженные клетки позже смогут дифференцироваться в любые из многочисленных тканей, из которых состоит организм. Однако этот этап отличается особенной неэффективностью. Считается, что именно незавершенное перепрограммирование виновато в том, что в результате клонирования путем ядерного переноса развивается столь малое число эмбрионов и у них так часто наблюдаются пороки развития.
Сбой может произойти не только на этапе перепрограммирования. Даже если клетки перепрограммировались должным образом и из них развились жизнеспособные эмбрионы без пороков развития, иногда зародыш не имплантируется в матку суррогатной матери или беременность прерывается уже после имплантации плодного яйца. Это может происходить вследствие пока неизвестных нам особенностей репродуктивного цикла или же из-за какой-либо несовместимости между суррогатной матерью и развивающимся эмбрионом. Подобные несовместимости с большей вероятностью будут встречаться при межвидовом клонировании (включая эксперименты, при которых весь зародыш и его суррогатная мать принадлежат к разным видам), чем при клонировании в пределах одного вида. Кроме того, без сомнений, экспериментальные манипуляции вызывают стресс у суррогатных матерей, и этот стресс может быть одной из причин повышенного процента выкидышей в экспериментах по клонированию.
Пугливые козероги и гибридное решение
Разумеется, стресс стал одним из ограничивающих факторов в экспериментах по клонированию букардо.
Готовясь к работе с клетками букардо, группа ученых, проводившая этот проект, сделала первую попытку межвидового клонирования с привлечением другого, сравнительно широко распространенного подвида пиренейского козерога. После того как ученые разработали и полностью протестировали эту технологию, они перешли к клонированию букардо.
Чтобы осуществить план, им были нужны эмбрионы пиренейского козерога. Чтобы создать эти эмбрионы, ученым вначале пришлось поймать в горах несколько пиренейских козерогов. Затем нужно было некоторое время продержать козерогов в неволе, чтобы понаблюдать за их репродуктивным поведением и разработать способ вызвать у самок овуляцию. Увидев, что козероги спариваются, ученые взяли бы у самок оплодотворенные яйцеклетки, имплантировали бы развивающиеся эмбрионы домашним козам, а затем оставалось бы только надеяться на лучшее.
Получить оплодотворенные яйцеклетки пиренейского козерога оказалось намного сложнее, чем рассчитывали исследователи. Привыкшие взбираться по крутым скалистым склонам, пиренейские козероги избегали манипуляций ученых, спасаясь на уступах в стенах вивария высоко под потолком (ил. 15). Когда ученым наконец удалось взять у самок яйцеклетки, оказалось, что среди них нет ни одной оплодотворенной. Похоже, стресс, вызванный жизнью в неволе, помешал им успешно спариться.
Ученым удалось придумать способ работы с козерогами, вызывающий у животных меньше стресса, и, в конечном итоге, удалось добыть оплодотворенные яйцеклетки пиренейских козерогов, содержавшихся в неволе. Но воодушевление, вызванное этим успехом, продлилось недолго, так как обнаружилась еще одна серьезная проблема: ни один из эмбрионов не продолжил развиваться после имплантации в матку домашней козы. Похоже, эмбрионы пиренейских козерогов были несовместимы с матками домашних коз. Это была плохая новость для проекта по клонированию букардо.
Полагая, что причина в генах, ученые решили подобрать другую суррогатную мать, генетически более близкую развивающемуся эмбриону. Лучше всего подошла бы представительница подвида пиренейского козерога. Однако ученые уже знали, что с пиренейскими козерогами трудно работать и они плохо чувствуют себя в неволе. Не желая проводить каждый день в попытках убедить козерогов спуститься вниз со стен, ученые решили пойти на компромисс: создать гибридных особей. Скрестив домашних коз с самцами пиренейского козерога, они получили бы детенышей с 50 % ДНК пиренейского козерога, и, что важнее всего, эти детеныши наверняка предпочли бы держаться поближе к земле. По достижении взрослого возраста гибридные самки должны были стать суррогатными матерями для эмбрионов пиренейского козерога.
Спустя примерно год ученые имплантировали эмбрионы пиренейского козерога самкам – гибридам козы и козерога – и вновь стали надеяться на лучшее. Чудесным образом беременность успешно наступила в половине случаев, и в результате на свет появились здоровые детеныши пиренейского козерога.
Мне следует обратить ваше внимание на то, что такой высокий показатель успешности – пятидесятипроцентная выживаемость имплантированных эмбрионов – обусловлен тем, что в этом эксперименте не был задействован ядерный перенос. В проекте с самого начала использовались здоровые эмбрионы, взятые у живых козерогов, а не соматические клетки, требующие перепрограммирования. Как я уже упоминала ранее, этап перепрограммирования, ставший первым шагом в эксперименте по возрождению букардо, отличается крайне низким процентом успешных исходов.
Непредвиденные преграды на пути восстановления вымерших видов
Разрабатывая технологию искусственного оплодотворения пиренейских козерогов, группа ученых, занимающаяся клонированием букардо, обнаружила, что эмбрионы букардо (в случае, если ученым удастся зайти так далеко в своем эксперименте) смогут развиться в организмах суррогатных матерей – гибридов домашней козы и пиренейского козерога, – но чистокровные домашние козы вряд ли для этого подойдут. Ученые обнаружили преграду для межвидового клонирования, возникшую в ходе эволюционного расхождения этих двух видов.
С точки зрения науки возрождения вымерших видов важно, что вероятность появления подобных преград увеличивается вместе с эволюционной дистанцией. Для вымерших видов, не имеющих близких эволюционных родственников, может не найтись подходящих суррогатных матерей. Однако эксперимент с козерогами показал, что такие преграды могут существовать и между видами, находящимися в близком родстве. Редактирование генома способно даже стать причиной появления таких барьеров, если, к примеру, будут прерваны важные взаимодействия между эмбрионом и вынашивающей его самкой. Таким образом, даже те проекты по возрождению вымерших видов, в которых задействованы минимально отредактированные геномы, могут завершиться неудачей из-за непредвиденной несовместимости эмбриона и его суррогатной матери.
Некоторые виды несовместимости могут проявить себя еще до стадии имплантации. К примеру, если яйцеклетка несовместима с соматической клеткой, ядро которой в нее перенесли, то ни одна такая яйцеклетка не превратится в эмбрион, даже если соматические клетки были правильно и полностью перепрограммированы. Подобная проблема может возникнуть, к примеру, когда ядерный геном соматической клетки несовместим с митохондриальным геномом яйцеклетки.
Митохондрии – это органеллы, живущие в цитоплазме клетки, и они не входят в состав ядерного генома. Все митохондрии, расположенные во всех клетках организма, происходят от митохондрии яйцеклетки, из которой развился организм. У митохондрии есть свой собственный геном, кодирующий некоторые белки, необходимые для клеточного дыхания (процесса, в ходе которого клетка перерабатывает кислород и простые углеводы в энергию). Другие белки, участвующие в клеточном дыхании, вырабатываются генами, расположенными в ядре. В случае несовместимости митохондриального и ядерного геномов эти гены также могут оказаться несовместимыми. Если же они не будут работать сообща, обеспечивая клеточное дыхание, это может привести к нарушениям обмена веществ, неврологическим заболеваниям и даже смерти. До сих пор все проекты межвидового клонирования включали только перенос ядерной ДНК, но не митохондриальной.
Исследователи из лаборатории Дэвида Рэнда в Брауновском университете продемонстрировали, как несоответствие ядерной и митохондриальной ДНК может привести к появлению необычных фенотипов у в остальном обычных межвидовых гибридов. Ученые из лаборатории Рэнда создали дрозофил, обладающих ядерной ДНК Drosophila melanogaster и митохондриальной ДНК Drosophila simulans – двух видов мушек, разошедшихся около 5,4 миллиона лет назад. Получившиеся в результате мушки с не соответствующими друг другу геномами имели на спинах ворсинки, были в два раза меньше, чем нормальные мушки, страдали пороками развития, плохо размножались и, чего и стоит ожидать при недостаточной выработке энергии, уставали быстрее мушек с совпадающими геномами.